抗生素耐药性正在全球蔓延，为响应“ONE HEALTH”理念，减少相关健康和生态环境风险，迫切需要开展有效缓解环境耐药性的相关研究。CRISPR/Cas9基因编辑技术在清除耐药基因上有着巨大的潜力，但目前缺乏有效的CRISPR/Cas9递送系统。本研究以氮掺杂碳点（nitrogen-doped carbon dots，NCDs）为纳米载体，通过共价结合负载Cas9蛋白，合成NCDs-Cas9/sgRNA纳米复合材料。采用SDS-PAGE和TEM等方法表征NCDs和Cas9蛋白之间的偶联。以携带常见耐药基因（tet，cat，和aph(3')-Ia）的大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）为研究对象，实现了NCDs-Cas9/sgRNA对E. coli 细胞内耐药基因的敲除（27.1-46%）；并通过荧光显微镜观察NCDs-Cas9/sgRNA在E. coli 的分布，结合qRT-PCR和流式细胞术验证耐药基因的敲除。此外，构建了NCDs-Cas9/sgRNA的多重基因编辑系统：装载3种sgRNA的NCDs-Cas9/sgRNA同时敲除E. coli 中tet，cat，和aph(3')-Ia基因，并在无菌土中验证了NCDs-Cas9/sgRNA对土壤环境中耐药基因的编辑。本研究制备了一种快速而精准的基于纳米材料的耐药基因多重编辑，展示了CRISPR/Cas9从基因水平减少环境抗生素耐药性的潜力，为应用CRISPR/Cas9开展环境耐药性污染治理提供了技术支撑。
 

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